RNA的制备与分析对于了解基因在转录水平上的表达与调控和cDNA的合成都是必须的，RNA的纯度和完整性对于Northern blot，RT-PCR和cDNA文库的构建等分子生物学实验都至关重要。RNA分离的方法很多，本实验利用Trizol法。

　　实验原理

　　Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。

　　用这种方法得到的总RNA中蛋白质和DNA污染很少，可以用来做Northern，RT-PCR，分离mRNA，体外翻译和分子克隆等。

　　实验仪器和耗材

　　仪器：乳钵、台式冷冻离心机、Nano-drop、PCR仪、水平电泳槽、加样枪、无RNA酶的枪头、EP管、手套、口罩、冰盒

　　实验试剂：0.1%DEPC 水(或注射用水-安瓿)、Trizol试剂、氯仿、异丙醇、75%乙醇、随机引物、dNTP、逆转录酶和配套buffer、PCR引物、PCR buffer、TaqE、TAE电泳缓冲液、琼脂糖、EB

　　实验步骤

　　总RNA的提取

　　1 乳钵用去离子水洗净、擦干

　　2乳钵中倒入少许液氮冷却(戴手套)

　　3取组织标本适量(30mg，半个绿豆大小)放在乳钵中，加Trizol 1ml, 在冰冻状态下两者一起仔细磨碎，吸入1.5ml管中，室温放置5分钟

　　a标本从-70C冰箱转至液氮瓶中

　　b标本块可在再加入少许液氮，在冰冻状态下杂碎，冻存的标本太大又不易砸成小块者，也可用Trizol 1ml研磨，然后只吸取其中的一部分，再加Trizol 至1ml

　　c在此阶段可将标本放在-20C保存数周

　　4加氯仿200μl, 用力震荡15s，可用枪吹打，静置2min

　　5 离心 13000rpm，15min

　　4C离心并非必需， 离心时应该养成将盖把靠外的习惯，这样可防止沉淀丢失

　　6 从塑料管盖把的对侧处小心吸出上清(水相)至另一新EP管中，留1-2mm上清，避免将介面及贴于塑料管侧壁的沉淀物吸出

　　7加异丙醇500μl, 上下颠倒混匀，静置2min

　　8 13,000转离心15min

　　4C离心并非必需，标本量很小时可先在-20C放置15分钟后再离心

　　9换手套，小心吸去上清，留沉淀，13,000转短暂离心数秒钟，吸尽液体

　　A不要用倒去上清的方法，以免RNA沉淀丢失

　　10加1ml 75%乙醇，轻轻上下颠倒数次，洗涤沉淀

　　A从这一步开始RNA失去了Trizol的保护，要格外小心避免RNA酶的污染

　　B也可在加75%乙醇后-20C保存数周，再向下进行

　　11 13,000转离心5分钟

　　12小心吸去上清，留沉淀，13,000转离心数秒钟，吸尽管壁残留液体

　　A不要用倒去上清的方法，否则容易丢失沉淀

　　B标本量很少时可能看不见沉淀，此时应该从管盖把对侧的方向吸去上清，以免搅动管壁上的沉淀

　　13室温放置5-15分钟，至乳白色沉淀刚呈半透明状

　　目的是将残余乙醇挥发净，不要放在加热器上，过度干燥后的RNA很难溶解

　　14加DEPC水20-30μl 混匀, 放置在冰上备用

　　若溶解不好，可在55C加热器上放置5分钟，并混匀数次

　　RNA的浓度测定

　　1取2-3μl在260nm分光光度计定量

　　260/280=1.7-2.0 较好;<1.7 蛋白或苯酚的污染;>2.0 异硫氰酸胍的污染

　　此方法不能确定RNA是否被降解

　　2 普通琼指糖凝胶电泳

　　可见三条带28S/18S/5S+tRNA=4.8kb/1.9kb/0.1-0.3kb

　　此方法不能确定RNA是否被降解

　　3 RNA 甲醛变性电泳 28S/18S=2：1

　　可看28S, 18S形态，确定RNA是否被降解，检测RNA的完整性

　　RT-PCR

　　(去除DNA污染)

　　25μL 体系

　　总RNA 2μg(2-5μg)不大于10μL

　　10μM随机引物2μL

　　ddH2O or DEPC水

　　17.75μL

　　加热70C, 5min后立即放在冰上2min，再短暂离心将液体集中于管底

　　5 x 逆转录酶Buffer(含DTT) 5μl

　　10mM / 各 dNTPs 1.25μl

　　M-MuLV逆转录酶 1μl

　　42C (oligo d(T )12-18 引物) 或 37C(随机引物)一小时

　　-20C 保存

　　手上的DNA酶污染标本后cDNA很容易被降解， 因此要戴手套，用消毒过的吸头，避免手接触管盖内侧，并在冰上操作。

　　PCR

　　1. PCR反应体系，以总体积25μl为例

　　10 x PCR buffer(含Mg2+ 1.5mM) 2.5μl

　　2.5mM/每种 dNTP 1μl

　　2.5pmol/各 引物 2μl

　　cDNA模板 2μl

　　水 加至24.75μl

　　Taq DNA 聚合酶 0.25μl

　　2. PCR反应条件

　　预变性 94C 5min

　　35个循环 94C 30s

　　55C 30s

　　72C 30s

　　延伸 72C 5min

　　3 PCR产物电泳鉴定

　　1、凝胶准备 用1×TAE配制2%琼脂糖凝胶。

　　① 称0.8g琼脂糖置三角瓶中，加40ml 1×TAE

　　② 微波炉加热大约1分钟，熔化琼脂糖

　　③ 熔化的琼脂糖自然冷却到60～70℃时，加入EB 2μl(终浓度0.5μg/ml )，并轻轻混匀

　　2、铺胶：将冷却致60℃的凝胶倒入准备好的胶床内，凝胶厚度3～5mm

　　3、室温下静置30分钟，凝胶固化，轻轻拔出固定在凝胶中的梳子。

　　4、上样：用加样器吸取样品加入到凝胶的样品孔中，加样量一般5-10μl

　　5、盖上电泳槽，接通电源，开始电泳

　　开始电泳前，再次确认凝胶样品孔处于电场的负极。

　　电泳条件：电压50v-80v(一般电压为5-15V/cm) ;时间0.5小时左右

　　6、电泳结果分析：

　　紫外检测仪直接观察电源条带，大约270bp

　　注意事项：

　　1 抽提及操作RNA中要谨防RNase的污染

　　操作RNA的试剂及器皿都要进行相应的处理。无RNA酶污染的1.5ml塑料管，0.2ml PCR管，20μl, 200μl,1000μl吸头进口原装的。

　　2组织离体后应尽快冰冻保存或立即在Trizol 中裂解

　　事先切成合适大小，约30mg(大约半个绿豆大)组织块大小或细胞数要合适，不要太大太多。冰冻后的组织在提取RNA之前不能融化。