1. 细胞水平要做western blot，多少细胞提的蛋白够做western blot?

　　解答：一般5×10^6就足够了

　　2. 如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么?

　　解答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多，这时最好

　　NaF去抑制磷酸化酶的活性。

　　3. 想分离的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适?积层胶的浓度又该用多少?这么大分子量的蛋白容易作Western Blot吗?

　　解答：260kd的蛋白不好做， 分离胶用6%， Stacking Gel 3.5%。还可选

　　用金斯瑞的预制胶

　　4. 蛋白变性后可以存放多久?

　　解答：-80℃，一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉;不要

　　细菌消化掉(也是被酶水解了)。

　　5. 做组织样品的western的时候，处理样品有什么诀窍吗?还有，您用过大牛血清做封闭剂吗?浓度如何?效果是不是比BSA好一点?

　　解答：必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧 烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性(加入PMSF和蛋白酶抑制剂cocktail)，封闭剂一般5%脱脂奶粉较常用。如果一抗为多克隆抗体，使用BSA也是不错的选择。

　　6. 免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗?

　　解答：疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇(又称表位)，有些表位是线性的，而有的属于构象型;线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有;构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。(限于单抗)

　　7. Western Blot 中抗体的重复应用问题

　　解答：抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反

　　使用2-3次。稀释后应在2-3天内使用，4度保存，避免反复冻融。

　　8. NC膜\ PVDF膜\ 尼龙膜怎样鉴别?

　　解答：尼龙膜是较理想的核酸固相支持物，有多种类型;硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物，价格最便宜;PVDF膜介于二者之间。

　　就结合能力而言：尼龙膜结合DNA和RNA能力可达480-600μg/cm2，可结合短至10bp的核酸片段;硝酸纤维素膜结合DNA和RNA能力可达80-100μg/cm2，对于200bp的核酸片段结合能力不强;PVDF膜结合DNA和RNA能力可达125-300μg/cm2。

　　就温度适应性而言：尼龙膜经烘烤或紫外线照射后，核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上的正电荷结合;硝酸纤维素膜依靠疏水性相互作用结合DNA，结合不牢固;PVDF膜结合牢固，耐高温，特别适合于蛋白印迹。

　　就韧性而言：尼龙膜较强;硝酸纤维素膜较脆，易破碎;PVDF膜较强。

　　就重复性而言：尼龙膜可反复用于分子杂交，杂交后，探针分子可经碱变性被洗脱下来;硝酸纤维素膜不能重复使用;PVDF膜可以重复使用。

　　9. 在做Western Blot时，PVDF膜用甲醇浸泡的目的?

　　解答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。

　　10.跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么原因呢?是有的成分不对吗?

　　解答：没什么问题，就是你胶里的水分被蒸发了。过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点水保持湿度就可以了。如果过夜，胶里的水分被蒸发，采用保鲜膜包上也可以;也可能母液(30%聚丙酰胺)有问题，你可以重新配制一份观察;能够替换的试剂，尽量换一下，选用好的试剂，避免找问题麻烦。脱色液中甲醇的含量太高也会造成胶缩。

　　11.不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上， 转移效率低怎么样解决?

　　解答：可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇(是指终浓度)(优化的转移缓冲液，可以参考《蛋白质技术手册》)，因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间;转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率;用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜(0.2微米);使用戊二醛交联;低浓度胶，如低至6%。太大时还可以考虑用琼脂糖胶;提高转移电压/电流;增加转移时间。

　　12.Western Blot哪种染色好?

　　解答：(1)阴离子染料是最常用的，特别是氨基黑，脱色快，背景低检测极限可达到1.5μg，考马虽然与氨基黑有相同的灵敏度，但脱色慢，背景高。丽春红S和快绿在检测后容易从蛋白质中除去 ，以便进行随后的氨基酸分析。缺点是：溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的 皱缩或破坏。不能用于正电荷的膜。灵敏度低。

　　(2)胶体金，灵敏度高，检测范围可到pg级，但染色比稳定。

　　(3)生物素化灵敏度位于1、2之间，可用于任何一种膜。

　　13.转膜时采用电流是否比电压准确，是否根据0.8mA/cm2，一般1小时左右?

　　解答：不是的， 半干法推荐用恒流，一般根据目的蛋白的大小来确定电流和时间。

　　14.加甲醇的目的是什么?

　　解答：加甲醇起着一定的固定作用，因为小分子蛋白质容易转出去.(特别是在硝酸纤维素膜上，因为NC膜结合蛋白质的能力较弱)。

　　15.请问一下PVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么?

　　解答：一般而言，硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联，这样的话，反复洗几次后，蛋白容易掉下来，结果较差。尼龙膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合(注：常用的PVDF即带正电荷的尼龙膜)，同时也有疏水作用，但相对较弱。这样的话，PVDF膜和蛋白接合较牢，不易脱落，结果较好。

　　16. 1、煮好后的样品，若没有及时上样分离，应如何保存，可以保存多久?2、有没有人在用bio-rad的小型垂直电泳槽，有没有操作手册?3、湿式转移时是否必须要用bio-rad的专用滤纸?4、恒压转移的条件如何确定，因为我要分离小至21KD，中至66KD，大致170KD的蛋白质，转移条件能够相同吗?5、凝胶的浓度是不是可以用一个浓度?书上写不同的凝胶浓度分离的分子量范围不同，还给出了一个线形范围，是不是不在这个范围内也能分离，只是就不是线性范围了?

　　解答：1、煮好后的样品，放到-20，我们在一个月后此样品，效果一样。

　　2、bio-rad的小型垂直电泳槽的操作手册在他们的主页Bio-Rad USA上有。

　　3、转移时一般的WATERMEN滤纸就可以。

　　4、转移条件是和蛋白质大小有关的：以次确定电压和时间。具体可让ptglab帮你定夺。

　　5、凝胶的浓度也是和分离蛋白质大小有关。不是随心所欲选的，否则分离效果可能不是你所期望的。

　　17.想用Western检测基因转染后细胞培养上清中表达的目的蛋白(定性)，分子量为20KD，浓度约为几百ng/ml。蛋白样品需浓缩、纯化吗?如何浓缩、纯化上清液中的目的蛋白?对小分子蛋白Western blot时需特别注意哪些条件?

　　解答：按照你提供的浓度，如果做Western Blot，是不用浓缩样品的. 对于20kd的小分子的蛋白，Western Blot中要注意的是：

　　1、转移时的时间，

　　2、转移时的电流或电压.

　　3、transfer buffer 中加20%的甲醇.

　　4、可以用13-15%的分离胶.

　　18.怎样才能把胶跑的非常漂亮，泳道和band都能很直，是不是上样的量很重要，罐胶有什么技巧吗?想跑漂亮，是不是应该先小电压，再高电压，总体上电压小些会跑的好些?还有前面有人说电泳液平玻璃板会使电泳条带漂亮些?

　　解答：影响跑胶跑的质量，有以下几个因素：1、电压，小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小，条带越漂亮，浓缩胶80v，分离胶100v就能跑得很好。2、胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。倒胶之前，一定要充分混匀，玻璃板一定要干净，双蒸水隔离时，一定要比较轻地加上去，避免稀释上层的分离胶。

　　19. “转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉”，其中TBST最后那个T是Tween吗，浓度多大?

　　解答：是Tween，配方如下:Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST), Dissolve 8.8g of NaCl， 0.2g of KCl， and 3g of Tris base in 800ml of distilled H2O, Add 500ul of Tween-20, Adjust the pH to 7.4 with HCl, Add distilled H2O to 1L, Sterilize by autoclaving.