1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天

　　1) 二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟;

　　2) 无水乙醇浸泡2次，每次3分钟;

　　3) 95%乙醇浸泡2次，每次3分钟;

　　4) PBS清洗3分钟;

　　5) 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟;

　　6) PBS清洗10分钟;

　　7) 加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育15分钟;

　　8) PBS清洗2次，每次3分钟;

　　9) 0.2N的HCl孵育30分钟;

　　10)PBS清洗2次，每次3分钟;

　　11)0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟;

　　12)PBS清洗2次，每次5分钟;

　　13)预杂交缓冲液孵育30分钟;

　　14)准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85℃加热5分钟，

　　置于冰块中10分钟;

　　15)杂交;第二天

　　16)将玻片置于SSC中2次，每次5分钟以去除封片;

　　17)PBS清洗3分钟;

　　18)RNA酶A溶液中(或0.1-1ng/mlPBS中)，37℃孵育30分钟;

　　19)PBS清洗5分钟;

　　20)室温，2×SSC清洗10分钟;

　　21)37℃，1×SSC清洗10分钟;

　　22)37℃，0.5×SSC清洗10分钟;

　　23)缓冲液A孵育10分钟;

　　24)缓冲液A(1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100)孵育30分钟;

　　25)加入抗地高辛抗体(1/200的上述缓冲液，来自Boehringer Mannheim)，

　　37℃孵育3 小时;

　　26)缓冲液A清洗2次，每次10分钟;

　　27)缓冲液B清洗2次，每次5分钟;

　　28)制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚

　　佳，显色时间可延长到16小时;

　　29)停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗;

　　30)固红，脱水以及封片进行核的复染。

　　2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天

　　1) 二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟;

　　2) 无水乙醇浸泡2次，每次5分钟;

　　3) 95%乙醇浸泡2次，每次5分钟;

　　4) PBS清洗5分钟;

　　5) 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟;

　　6) PBS清洗5分钟;

　　7) 加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育10分钟;

　　8) PBS清洗2次，每次5分钟;

　　9) 0.2N的HCl孵育30分钟;

　　10)PBS清洗2次，每次5分钟;

　　11)0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟;

　　12)PBS清洗5分钟;

　　13)预杂交缓冲液孵育30分钟;

　　14)准备寡核苷酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针;

　　15)杂交;第二天

　　16)将玻片置于SSC中以去除封片;

　　17)室温，2×SSC清洗10分钟;

　　18)37℃，1×SSC清洗10分钟;

　　19)37℃，0.5×SSC清洗10分钟;

　　20)缓冲液A孵育10分钟;

　　21)缓冲液A孵育30分钟;

　　22)加入抗地高辛抗体37℃孵育3小时;

　　23)缓冲液A清洗2次，每次5分钟;

　　24)缓冲液B清洗2次，每次5分钟;

　　25)制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚

　　佳，显色时间可长到16小时;

　　26)停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗;

　　27)固红，脱水以及封片进行核的复染。